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              2. 芍藥休眠芽發育進程內源激素變化研究

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                點擊次數:3179 更新時間:2015年12月08日18:49:46 打印此頁 關閉

                   芍藥是我國傳統名 花,栽培歷史悠久。芍藥的花期集中在 4 月下旬至 5 月上旬,不能滿足周年供應。在長期的系統演化過程中,芍藥形成了冬季低溫休眠的特性,其種子和芽均須經過一定的低溫過程才能破除休眠而萌發,這種休眠表現為秋季先產生根系,經歷一段寒冷低溫時期打破上胚軸和芽休眠后再出土萌發。

                在北京地區,芍藥休眠芽的發育進程是 10 月底至 11 月初地上部分枯死,根莖上著生的混合芽在土壤內越冬,次年春天再萌芽生長。要實現芍藥的商業生產可以利用冷藏和赤霉素處理解除芍藥花芽休眠,再轉入適宜生長的條件下培養一定時間,即可誘導芍藥春節前后開花。

                   研究表明,植物休眠由內源激素控制,休眠的起始、終止和調控以及休眠各階段的變化均受激素調節,而且不是單一激素調節,而是由多種激素之間的平衡所控制,涉及芽休眠的激素有脫落酸( ABA) 、赤霉素( GA3) 、細胞分裂素( ZT)和生長素( IAA) 。以往的研究多集中在植物激素與木本植物芽休眠的關系上,如楊樹、杉木等。鄭國生等對芍藥科木本植物牡丹花芽的研究顯示,低溫期內 GA3,ABA,CTK 質量分數的增減和 GA3/ ABA 比值的變化可明顯地反映低溫解除花芽休眠的進程。其中,GA3/ ABA 比 值的變化與休眠的進程直接對應,并證明了 GA3CTK 是解除休眠的促進物,ABA 是解除休眠的抑制物。Mornya 等指出,牡丹在秋季花芽分化期IAA GA3的含量增加,ABA 的含量減少,從而誘導開花。Mornya 等認為牡丹秋季二次開花可以通過調節 GA3,IAA CTK 的含量來實現,但對于宿根花卉芍藥的內源激素研究還是空白。本研究采用高效液相色譜技術( HPLC) ,分別測定了芍藥芽休眠進程中赤霉素( GA3) 、生長素( IAA) 、細胞分裂素( ZT) 、脫落酸( ABA) 含量及其比值的動態變化,探討了內源激素在低溫打破休眠中的調節作用,這對于芍藥反季節催花時外源激素的施用,具有一定的指導意義。

                    1 材料與方法11 材料2009 10 21 日至 2010 3 月選取生長健壯、4 年生大富貴芍藥品種進行花芽采集,每隔10 d 取一次芽,剝除外層鱗片,液氮處理材料后進行超低溫保存,用于 GA3,IAA,ZT,ABA 濃度含量測定,取樣標準為縱徑 × 橫徑≥1. 5 cm × 0. 5cm 的頂芽,每處理每次取樣 8 10 個芽。12 方法全部取樣完成后,采用液相色譜分析法測定各類激素的濃度。稱取上述材料各 0. 5 g,放入冰研缽內,加入少量銅試劑( 抗氧化劑) 和少量( 10 m L) 80% 冷甲醇,低溫研磨成勻漿,4℃ 浸泡過夜。次日取出樣品并加入適量 PVP( 非水溶性聚乙烯吡咯烷酮) ,放于搖床上 10 min,再將勻漿在室溫下抽濾,殘渣以 80% 冷甲醇沖洗 3 4 次,抽濾后合并提取液。給提取液加 1 2 滴氨水,35 40℃ 減壓濃縮至水相,用蒸餾水轉移入 10m L 離心管中,在 6 000 r·min1下離心 20 min,棄殘渣,將上清液均勻分成兩份。一份用 1 mol·L1HCl 調至 p H 2. 5 3. 0,用等體積乙酸乙酯萃取 3 次,合并有機相,加 1 2 滴氨水,35 40℃濃縮至干,然后用 3% 色譜甲醇與 97% 0. 1 mol·L1HAc 的混合溶液溶解濃縮干的物質并定容至1 m L,用 0. 45 μL 微膜過濾,用于測定 IAA,GA3,ABA 的含量。另一份用 1 mol·L1的氨水調至p H 7. 5 8. 0,用等體積 p H 8. 0 磷酸緩沖液飽和的正丁醇萃取 3 次,合并有機相,60℃ 濃縮至干,然后用 3% 色譜甲醇與 97% p H 7. 0 超純水的混合溶液溶解濃縮 干的物質 并定容至 1 m L,用0. 45 μL 微膜過濾,用于測定 ZT 的含量。采用高效液相色譜( HPLC) 法,色譜條件:Agilent 1100 高效液相色譜儀,C18( 250 × 4. 6mm) ,二極管陣列檢測器,四元泵,自動進樣器,柱溫箱 30℃,在線脫氣機,流動相分別為: 測定IAA,GA3,ABA 采用 3% 色譜甲醇與 97% 0. 1mol·L1HAc 的混合溶液,測定 ZT 采用 3% 色譜甲醇與 97% p H 7. 0 超純水的混合溶液,檢測波長分別為: IAA280 nm,ABA260 nm,GA3210 nm,ZT267 nm,流速為 1 m L·min1,外標法定量,標樣均為 Sigma 產品。2 結果與分析21 芍藥休眠芽內源激素含量動態變化21. 1 生長素( IAA) 含量隨時間的變化花芽休眠階段生長素含量很低,總體變化幅度不大。從圖 1 中可以看出,10 20 日至 11 10 日花芽 IAA 含量下降,此時芍藥已基本停止生長; 隨后 IAA 的含量開始增加,11 20 日達到頂峰。經分析,其產生的原因可能是休眠芽聚集能量,以抵御寒冷的氣候和為幼芽提供過冬的營養物質。此后,IAA 含量開始大幅下降,12 20 日至 3 3 日均處于較低水平。直到 3 13 日,IAA 含量大幅上升,此時芍藥開始萌發。由此可以得出,IAA 含量在休眠期內的變化呈現先下降后上升再下降,然后一直處于較低濃度水平上的規律,雖然 IAA 含量最后在休眠解除期有明顯增加,但并不能就此確定 IAA 直接參與休眠的解除,在解除休眠中可能無明顯的作用,而作用于花芽解除休眠后的萌發生長,更確切的結論有待進一步驗證。

                  2. 1. 2 赤霉素( GA3) 含量隨時間的變化早在 1964 年,Eagles 等在用假挪威槭為材料的研究中指出,休眠芽的萌發是因為 GA 等生長促進物質克服了生長抑制物質的抑制作用,從而導致了休眠的解除。之后的許多試驗證實,休眠的解除與 GA 類物質的積累總是相伴發生的。從圖 2 中可以得出,隨著低溫期的延長,花芽內 GA3含量呈現先下降后上升的趨勢。具體表現為 10 20 日至 11 20 GA3含量下降,此時花芽開始停止活動,進入休眠; 此后 GA3含量開始增加,12 30 GA3含量達到頂峰,最高值出現在花芽的深度休眠期; 之后 GA3含量開始下降,在花芽萌發期降至最低值,說明休眠芽中 GA3含量隨休眠深度的加深而增加,隨休眠的解除而減少,2 20 日休眠解除時 GA3含量趨于平穩。因而,內源 GA3可打破休眠,促進萌發,但休眠破除過程和萌芽過程是截然不同的兩個階段,內外條件的變化對這兩者的影響也不同,而具體的條件變化對解除休眠和促進萌發的不同影響有待進一步研究。21. 3 脫落酸( ABA) 含量隨時間的變化ABA 具有增強植物抗逆性、誘導休眠的作用。從圖 3 中可以看出,11 20 ABA 含量開始增加,12 10 日花芽內源 ABA 含量達到最高,此時 GA3含量處于相對低的水平,而后 ABA含量開始下降,并在 1 20 日以后保持在較低的水平上。當 ABA 含量處于較高水平時,花芽處于深度休眠期,無法萌發; 當休眠解除的時候,ABA 含量就降低到一定水平,以后變動幅度一直很小,說明 ABA 含量的下降與花芽休眠的解除相關,進一步驗證了 ABA 是花芽萌發的抑制物質?;ㄑ康男菝?,顯然與內源 ABA 的含量變化有關。從而可以得出結論,休眠芽的形成,有賴于秋季 ABA 的積累; 休眠的解除,可能取決于入冬后 ABA 含量的下降,這與朱永亮等[3]的研究結果一致。21. 4 細胞分裂素( ZT) 含量隨時間的變化多數研究認為細胞分裂素能夠克服存在于芽內的萌發抑制因子,同時細胞分裂素解除休眠的作用不能傳遞,只影響所施的芽[11]。從圖 4 中可以看出,10 20 日至 12 30 ZT 的含量逐漸攀升,到 12 30 日達到頂峰,在此期間可能是 ZT 增加了細胞分裂分化的速度,加厚角質層,提高對葉原基的保護能力。此時ZT含量與GA3

                含量變化趨勢一致,與 ABA 含量變化趨勢正好相反。ZT 含量 12 30 日開始下降,3 13 日隨著休眠的解除有所上升,此時,細胞分裂素可能促進細胞分裂和擴大,誘導花芽的分化。因此,ZT 能夠克服萌發抑制的因子,解除休眠,促進花芽的萌發。22 芍藥休眠芽中內源激素比值的變化根據前人對樹木的研究發現,內源激素的比值對植物休眠狀態的影響極為重要。本試驗也發現休眠芽內源激素比值變化比單一激素更能反映芍藥花芽的休眠進程。從圖 5 中可以看出,休眠芽中 IAA/ABA 的比值在整個過程中基本上沒有變化,而 GA3/ ABA,ZT / ABA 的比值變化趨勢大體相同。隨著花芽的休眠與解除,GA3/ ABAZT/ABA 的比值基本呈現先下降后急劇上升再下降的趨勢,到 1 30 日下降到一定水平后基本平穩,并與 11 20 日之前基本持平。由此可以認為 GA3,CTK ABA 均參與了這一期間的調控活動,三者的消長關系控制著芍藥植株花芽的休眠和解除休眠的進程。3 討論芍藥植株進入休眠后,必須接受一個低溫量值才能打破休眠,低溫解除休眠的程度與抑制物的消失、促進物的出現以及促進物/抑制物比值的變化有關。研究發現,IAA 的含量變化與芍藥花芽的發育過程相一致。當芍藥基本停止

                生長的時候,IAA 的含量開始下降; 隨著花芽進入休眠,IAA 含量開始上升。經分析,原因可能是休眠芽聚集能量,以抵御寒冷的氣候和為幼芽提供過冬的營養物質。此后,IAA 含量開始大幅下降,并處于較低濃度的水平上,可以分析得出IAA 可能并未直接參與休眠的解除。直到花芽開始萌發,IAA 含量再一次上升,推斷出 IAA 的作用在 于 花 芽 解 除 休 眠 后 的 萌 發 生 長,這 與Mornya和陳新露等的研究結果基本一致。經過初步分析,IAA 一般和營養積累有關,IAA 含量的增加是因為營養需求的增加,反之亦然。隨著低溫期的延長,花芽內 GA3含量呈現先緩慢下降后大幅上升再大幅下降的趨勢,可見GA3含量變化對于休眠解除有明顯的調節作用??梢酝茰y得出,低溫過程促進了 GA3的合成,當內源 GA3達到一定的閾值之后,休眠的解除開始啟動,從而增強了與休眠解除相關基因的表達,最終導致了休眠解除。這一結論驗證了生產上通過施用外源激素促進植株解除休眠、促進花芽分化,從而達到提早開花目的的可行性。但是與Koshita 等認為的 GA3對花芽的形成存在抑制或根本不起作用的觀點不一致,原因很可能是研究的植物種類存在差異,芍藥存在低溫休眠的特性,并且其花芽屬于花葉混合芽,開放時既開花又抽枝展葉,因此這種混合芽的特殊休眠機理很可能影響 GA3的作用機制。在芍藥休眠過程中,ABA 含量變化呈明顯的倒 V 形。隨著芍藥深休眠期的來臨,ABA 含量大幅增加,由此推斷 ABA 可以提高植株的抗逆性,增強對寒冷環境的抵御能力。隨著休眠的逐漸解除,ABA 含量開始下降,并趨于平穩。由此可見,ABA 含量的下降有利于芍藥休眠的解除和花芽的萌發,驗證了 ABA 是花芽萌發的抑制物質?;ㄑ康男菝?,顯然與內源 ABA 的含量變化有關。從而可以得出結論,休眠芽的形成,有賴于秋季ABA 的積累; 休眠的解除,可能取決于入冬后ABA 含量的下降,這與研究結果相一致,但與 Nakayama 等的研究結果相悖,他們認為 ABA 主要起促進作用,推測其不一致的原因可能與研究的環境條件和植物種類的不同有關。試驗表明,ZT 含量隨著休眠程度的加深而增加,由此推測 ZT 在這個過程中加快了細胞分裂分化的速度,加厚角質層,提高對葉原基的保護能力。隨著休眠的逐漸解除,ZT 的含量下降到一定水平后趨于平穩,此時,細胞分裂素可能促進細胞分裂和擴大,誘導花芽的分化。

                   從而得出結論,ZT 能夠克服萌發抑制的因子,解除休眠,促進花芽的萌發。不難發現,ZT GA3含量在休眠過程中變化趨勢基本一致,與 ABA 含量變化趨勢正好相反。通常認為,芽的休眠由內源激素控制,休眠的起始、終止和調控以及休眠階段的改變受激素調節,環境因素( 外部信號) 也通過影響激素( 內部信號) 的合成與運輸來影響休眠進而改變低溫需求量。但是,至今對于激素調控花芽休眠的機理仍只停留在猜測階段,缺乏更為有效的試驗手段。本試驗也只是通過研究內源激素的動態變化來分析其與花芽休眠的關系,外部 環 境因素的綜合影響還有待進一步研究。解除芍藥休眠是芍藥促成栽培成功的關鍵。通過本試驗發現,ABA 是芍藥休眠的促進物,而 GA3ZT 有利于芍藥休眠的解除,IAA在植物進入休眠前起到提供能量的作用,并在休眠結束后促進花芽的生長、分化。

                   芍藥的休眠進程取決于多種激素的平衡關系,而不是單一激素的含量多少。所以,筆者認為芍藥促成栽培的研究不應僅僅局限于通過施用外源 GA3解除芍藥休眠,而應充分利用其他植物激素,同時重視對外部環境因素綜合而深入的研究,尋求打破芍藥休眠的有效方法,從而促進芍藥的周年商業生產。

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